1   步地起原 porn 动漫

    GB 4789.29-xxxx《食物安寰宇度程序 食物微生物学考试 唐菖蒲伯克霍尔德氏菌考试》。

2   适用限制

    本纪律律例了食物中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的考试步地。

3   建树和材料

3.1   实验室老例灭菌建树。

3.2   雪柜：2℃～8℃、-20℃～-30℃。

3.3   恒温培养箱：26℃±1℃、36℃±1℃。

3.4   恒温水浴锅：46℃±1℃。

3.5   显微镜：10倍～100倍。

3.6   均质器。

3.7   离神思：3000r/min。

3.8   电子天平：感量0.1g。

3.9   比浊计。

3.10  锥形瓶：容量100 mL、500 mL。

3.11  无菌培养皿：直径90mm、直径150mm。

3.12  无菌透明玻璃纸、滤纸。

3.13  无菌灌胃器：1mL。

3.14  微生物生化断然系统。

3.15  小鼠：18g～20g，每一批次试验应使用团结品系的KM或ICR小鼠。

4   培养基和试剂

4.1  GVC增菌液：见A.1。

4.2  校正马铃薯葡萄糖琼脂（mPDA）：见A.2。

4.3  PCFA培养基：见A.3。

4.4  马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）：见A.2.1porn 动漫。

4.5  马铃薯葡萄糖半固体琼脂：见A.4。

4.6  卵黄琼脂：见A.5。

4.7  革兰氏染色液：见A.6。

4.8  氧化酶试剂：见A.7。

4.9  Hugh-Leifson培养基（O/F试验用）：见A.8。

4.10  卵白胨水（靛基质试验用）：见A.9。

4.11  缓冲葡萄糖卵白胨水（MR和VP试验用）：见A.10。

4.12  西蒙氏柠檬酸盐培养基：见A.13。

4.13  苯丙氨酸培养基：见A.14。

4.14  糖发酵管：见A.15。

4.15  半固体琼脂：见A.16。

4.16  抗O多价血清、型特异性因子血清（O-Ⅲ、O-Ⅳ、O-Ⅴ、O-Ⅵ、O-Ⅶ型、O-Ⅷ型）。

4.17  生化断然试剂盒。

5   考试纪律

唐菖蒲伯克霍尔德氏菌考试纪律见图1。

6  操作关节

6.1  样品责罚

无菌操作称取25g（mL）样品，置入盛有225mLGVC增菌液的无菌均质袋中（鲜银耳样品取1g，用剪刀剪碎，加入盛有20mLGVC增菌液的无菌均质袋中），用拍击式均质器拍打1min～2min；或置入盛有225mLGVC增菌液的无菌均质杯中，以8000r/min～10000r/min均质1min～2min；若样品为液态，漂浮混匀。

6.2  增菌

将上述样品增菌液置36℃±1℃培养20h～24h。

6.3  分离

用直径3mm的接种环取增菌液一环，鉴别划线接种于mPDA平板和PCFA平板，36℃±1℃培养24 h～48 h。不雅察各个平板上孕育的菌落，各个平板上菌落特征见表1。

表1 唐菖蒲伯克霍尔德氏菌在不同分离平板上的菌落特征

6.4  初筛试验

自聘用性琼脂平板上鉴别挑取5个以上典型或可疑菌落（低于5个全选），分区画线接种于卵黄琼脂平板，36℃±1℃培养。挑取培养18～24 h的菌落进行革兰氏染色及氧化酶试验。关于革兰氏染色阴性、氧化酶试验阴性的菌连续培养至48 h±2 h，关于卵磷脂酶阳性，带有虹彩环的单个菌落，接种PDA平板，36℃

±1℃培养24 h±2 h。

6.5  生化试验

从纯培养的PDA平板上挑取菌苔进行生化断然。唐菖蒲伯克霍尔德氏菌生化特征见表2。可聘用生化断然试剂盒或微生物生化断然系统。

表2 唐菖蒲伯克霍尔德氏菌生化特征

6.6  血清学分型断然（可聘用项）

6.6.1  菌体抗原的制备

将PDA平板36℃±1℃培养24 h±2 h 的培养物用无菌生理盐水洗下，热水浴（100 ℃）2h，3000r/min10min离心弃上清液，再用无菌生理盐水稀释至5×108～109 CFU/mL菌悬液，看成凝集试验用抗原。

6.6.2  菌体抗原的断然

用多价血清作念玻片凝集试验，同期用生理盐水作念对照。与多价血清凝集者， 纪律用O-Ⅲ、O-Ⅳ、O-Ⅴ、O-Ⅵ、O-Ⅶ、O-Ⅷ因子血清作念试管凝集试验。笔据试验效果，判定菌体抗原型。在生理盐水中自凝者不成分型。生化特征相宜，但不成与以上血清凝集者，需保留菌株作念进一步断然。

6.7  毒性试验

6.7.1 产毒培养

将初步断然为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的菌株接种PDA平板，36℃±1℃， 培养24 h±2 h，用灭菌接种环刮取适量菌苔，加到3mL无菌生理盐水的试管中， 配成1麦氏浓度（McFarland，MCF）的菌悬液（约为108CFU/mL），用无菌吸管吸取0.5mL，滴在铺好无菌玻璃纸的直径150 mm马铃薯葡萄糖半固体平板上，用无菌L棒涂布均匀，26℃±1℃培养5 d。取下带菌的玻璃纸，将半固体平板置于100℃流动蒸汽灭菌30 min。室温冷却后，置-20℃～-30℃雪柜过夜。将冰冻好的半固体平板置室温熔解，用无菌吸管吸出冻融液，经滤纸过滤至无菌试管或锥形瓶中（此为毒素粗提液），4℃避光保存。

同期，将未接种菌苔、铺好无菌玻璃纸的直径150 mm马铃薯葡萄糖半固体平板看成阴性对照，按照相似的试验步地制备阴性对照粗提液，4℃避光保存。

6.7.2 毒力测定

取毒素粗提液或经100℃水浴挥发后的5～10倍浓缩液，灌胃小鼠3只，每只 0.5 mL，不雅察至7 d。若菌株产生米酵菌酸，小鼠在灌胃后20 min～24 h内发病。主要症状为竖毛、萎糜烦恼、躁动，继而行步踉跄、肢体麻木、瘫软、抽搐，呈角弓反张状，呼吸仓猝、圆寂。

取阴性对照粗提液或经100℃水浴挥发后的5～10倍浓缩液，灌胃小鼠3只， 每只0.5 mL，不雅察至7 d。小鼠应健康存活。

6.7.3 米酵菌酸测定

毒力测定实验阳性时，鉴别取毒素粗提液，阴性对照粗提液，按照GB 5009.189推行。

7  效果讲解

生化试验相宜且毒性试验阳性，讲解检出唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（椰毒假单胞菌酵米面亚种）；生化试验和毒性试验有一项不相宜，讲解未检出唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（椰毒假单胞菌酵米面亚种）。

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